用意する試薬類

Binding Buffer

20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.0 M LiCl, 2 mM EDTA

Lysis/Binding Buffer

100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA, 1% LiDS, 5 mM dithiothreitol (DTT)
沈殿が観察された場合、室温まで温め、撹拌してすべてのコンポーネントを完全に溶解してください

Washing Buffer A

10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% LiDS

Washing Buffer B

10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA 10 mM Tris-HCl, pH 7.5

Reconditioning Solution

0.1 M NaOH

Storage Buffer Oligo (dT)₂₅

250 mM Tris-HCl, pH 7.5, 20 mM EDTA, 0.1% Tween-20, 0.02% NaN₃

操作方法

Dynabeadsの準備

1. ピペッティングまたは、ローラーにて回転させ（5分）、完全に Dynabeads Oligo (dT)₂₅ を再懸濁し、チューブへ200 µL（1mg）を移す
2. 磁石（DynaMag）に取り付け、上清を除去する
3. 磁石からチューブを外し、100 µLのBinding Bufferを加え、再懸濁する
4. 磁石に取り付け、上清を除去する
5. 磁石からチューブを外し、100 µLのBinding Bufferに再懸濁する

細胞溶解液からのmRNAの単離

1. 100 µLのBinding Bufferに再懸濁した洗浄済みの Dynabeads Oligo (dT)₂₅ を磁石に取り付け、上清を除去し、磁石から外して細胞溶解液を加える
   Note:
   細胞溶解液はDynabeads Oligo (dT)₂₅混合直前に溶解させたものか、使用直前まで-80℃で保存したものを使用してください
2. Dynabeads Oligo (dT)₂₅と溶解物をよく混合する
3. ローラー、あるいはミキサーを用いて室温で3 - 5分、アニーリングさせる。
   Note:
   もし、溶液に粘性がある場合にはアニーリング時間を増やしてください。このステップでサンプル中のmRNAはoligo dT配列にアニーリングされます
4. チューブを磁石に取り付け、2分間静置後、上清を除去する
5. Dynabeads - mRNA複合体にWashing Buffer A（0.5 – 1 mL）を加え洗浄する
6. チューブを磁石に取り付け、2分間静置後、上清を除去する
7. 続いてWashing Buffer B（0.5 – 1 mL）を加え洗浄する
8. チューブを磁石に取り付け、2分間静置後、上清（Washing Buffer B）を除去する
9. チューブを磁石から外し、10 – 20 µL 10 mMのTris-HCl, pH7.5に再懸濁させる
10. 75 – 80℃、2分間インキュベートする
11. チューブを磁石に取り付け、素早くmRNAを含む上清を新しいRNaseフリーのチューブへ移す

Total RNAからmRNAの精製

このプロトコルは75 µgのtotal RNAをスタートサンプルとしています

1. Total RNAサンプルを75 µL /100 µLになるようにdistilled DEPC-treated waterあるいは10 mM Tris-HCl, pH 7.5を調製する
2. 100 µLのBinding Bufferを加える。もしTotal RNAの量が75 µL /100 µL未満の場合は、Binding Bufferで最終的に200 µLになるように調整する
3. RNAの高次構造を解消するために65℃、2分間インキュベートし、直ちに氷冷する
4. 上記3のチューブに100 µLのBinding Bufferに再懸濁した洗浄済みのDynabeads Oligo (dT)₂₅を加える
5. ミキサー等で撹拌しながら室温で5分間アニーリングする
6. チューブを磁石に取り付け、2分間静置後、上清を除去する
7. 200 μLのWashing Buffer B（0.5 – 1 mL）を加え、慎重に2、3回ピペッティングしながら洗浄する。再度チューブを磁石に取り付け、2分間静置後、上清（Washing Buffer B）を完全に除去する
8. 上記7の洗浄ステップを繰り返す
9. チューブを磁石から外し、10 – 20 μLの10mM Tris-HCl, pH7.5に再懸濁させる
10. 75 - 80°C、2分間インキュベートする
11. チューブを磁石に取り付け、素早くmRNAを含む上清を新しいRNaseフリーのチューブへ移す

Dynabeads Oligo (dT)₂₅の再生

同一サンプルを使用する場合

mRNAを溶出した後のDynabeads Oligo (dT)₂₅は同一サンプルであれば再生することなく使用できます。
同じサンプルに対してmRNAを溶出したDynabeads Oligo (dT)₂₅を用いて、同じ操作を繰り返すことでさらにmRNAを単離することも可能です。

異なるサンプルを使用する場合

異なるサンプルを用いる場合には、Dynabeads Oligo (dT)₂₅を再生して使用してください。
5回まで再生して利用することができます。

Dynabeads Oligo (dT)₂₅の再生プロトコル

本プロトコルは最初に100 µLのDynabeads Oligo (dT)₂₅を用いた場合です

1. 使用したDynabeads Oligo (dT)₂₅を最初に分取した際と同量である100 µLのReconditioning Solutionを加え、懸濁液を新しいRNase-free のチューブへ移す
2. 65°C で2分間インキュベート
3. 磁石にセットして30秒間静置した後、上清を除去する
4. Reconditioning Solutionで2回洗浄する（1~3の操作を計3回おこなう）
5. Dynabeads Oligo (dT)₂₅を100 µLのStorage Bufferに懸濁する
6. 磁石にセットして30秒間静置した後、上清を除去する
7. 5 - 6の操作をあと2回（計3回）繰り返す（あるいはpHが8以下になるまでおこなう）
8. 100 µLのStorage Bufferに懸濁し冷蔵（2-8℃）で保管する
   Note:
   一度用いたDynabeads Oligo (dT)₂₅を保管する場合は、コンタミを防ぐためにオリジナルのバイアルには戻さず、別のチューブで保管してください

ご案内

このプロトコルは、一般的なmRNA抽出・精製に対するものです。
ここでは例としてDynabeads Oligo (dT)₂₅を200 µL（1mg）用います（目安：20-50 mg 動物組織サンプル、100 mg 植物組織サンプルまたは1 - 4 x 10⁶ cells）。これは必要に応じてスケールアップあるいはダウンが可能です。
詳細は各製品の添付書またはマニュアルをご参照ください。

関連情報

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