製品の特長

StemSpan™ Leukemic Cell Culture Kitで、慢性/急性骨髄性白血病細胞を培養、増殖できます

• ヒト骨髄性白血病細胞の培養、増殖、および薬物スクリーニングに最適
• インプットしたCD34⁺ CML細胞あたり、CD34⁺細胞を約65倍まで増殖
• インプットしたCD34⁺ AML細胞あたり、CD34⁺細胞を約30倍まで増殖

データ紹介

以下の実験では凍結保存した細胞を用いましたが、新鮮なサンプルでも同様の結果が予想されます。
また、低分子としてUM729の代わりにUM171を用いていますが、UM729（終濃度1 uM）でも同等の結果が期待されます。ただし、特定の条件で細胞増殖を最適化するには、さらに滴定が必要になる場合があります。UM171とUM729の比較データを含む詳細は、Fares et al. 2014を参照してください。

図1. 白血病ドナー由来CD34⁺細胞の分離
凍結保存したCMLまたはAMLの末梢血単核細胞（PBMC）および骨髄単核細胞（BMMC）を解凍し、細胞分離用に調製しました。EasySep™ Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit IIでCD34⁺細胞を分離しました。分離前（A, C）と後（B, D）のCD34⁺細胞の割合をフローサイトメトリーで測定しました。死細胞は光散乱プロファイルおよび生細胞染色で除外しました。この例では、CD34⁺細胞の純度は3％から82％（CML）および16％から93％（AML）にそれぞれ増加しました。

図2. CD34⁺ CML細胞の増殖
CD34+ CML細胞をUM171の添加有りまたは無しの条件下で、CD34⁺ Expansion Supplement（Exp）を添加したStemSpan™ SFEM IIで培養しました。培養7日後と14日後、培養細胞をCD45、CD34、CD90、CD45RAに対する蛍光標識抗体で染色し、ALDH活性測定のためALDEFLUOR™試薬（ST-01700）で染色し、フローサイトメトリーで分析しました。シーケンシャルゲートを使用して、CD45⁺、CD45⁺CD34⁺、CD45⁺CD34⁺CD90⁺CD45RA^-生存細胞（「Fluorescence Minus One」（FMO）コントロールに基づく）、およびALDHbr細胞（DEABコントロールに基づく）の割合を決定しました。
（A）培養7日目の典型的なフローサイトメトリーのプロファイル。（B, C）培養7日目と（D, E）14日目のサブセットの（B, D）頻度と（C, E）最初のCD34⁺細胞あたりの細胞数。CD34⁺ Expansion Supplementを添加したStemSpan™ SFEM IIは、培養中のCML細胞の増殖をサポートします。UM171の追加により、調べた全サブセットの増殖が促進されました（UM171なしの培養と比較して、培養7日目でCD34⁺ 前駆細胞が10倍、14日目で20倍に拡大）。
データは平均値±SEM（n = 6）で表示。P値はtwo-tailed paired Student’s t-testで計算（* P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.0001）。
調べた全6サンプルが培養・増殖できました。

図3. CD34⁺ AML細胞の増殖
CD34+ AML細胞を、UM171の添加有りまたは無しの条件下で、CD34⁺ Expansion Supplement (Exp) を添加したStemSpan™ SFEM IIで培養しました。培養7日後と14日後、培養細胞を蛍光標識抗体とALDEFLUOR™（ST-01700）で染色しました。（A）7日目の代表的なフローサイトメトリープロファイル。（B, C）7日目および（D, E）14日目のサブセットの（B, D）頻度、および（C, E）最初のCD34⁺細胞あたりの細胞数。CD34⁺ Expansion Supplementを添加したSFEM IIは、培養中のAML細胞の増殖をサポートします。UM171を追加で添加すると、調べた全サブセットの増殖を促進します（UM171なしの培養と比較して、培養7日目にすべてのサブセットが3倍、14日目に7倍に拡大）。データは平均値±SEM（n = 6）で表示。P値は、two-tailed paired Student’s t-testで計算（* P <0.05; ** P <0.01）。 調べた全10サンプル中6サンプルが培養・増殖できました。

図4. CD34⁺ CML細胞のコロニー形成能の維持
CML細胞はCD34⁺細胞を分離直後（培養0日目）、またはCD34⁺ Expansion Supplement (Exp) を添加したStemSpan™ SFEM II（UM171添加有りまたは無し）で7日間または14日間増殖させた後（図2参照）、MethoCult™ H4435 Enriched培地に播種してコロニーアッセイしました。コロニーを（A）STEMvision™でデジタル画像化し、手動でカウントしました。（B）インプットしたCD34⁺細胞あたりのコロニー総数を表したCFUアウトプット。各バーの上にある数字は6つの異なるサンプル（個々の条件ごとに8〜12個のコロニーを採取）のqRT-PCRで測定したBCR-ABL陽性コロニーの割合を示します。CD34⁺ Expansion Supplementを添加したSFEM IIは、培養中のコロニー形成前駆細胞の増殖をサポートします。UM171の添加はコロニー形成前駆細胞のアウトプットをさらに促進します（7日目で約3.5倍、14日目で約8倍）。シングルコロニーqRT-PCR分析により、0日目サンプルから形成したコロニーと、7日間および14日間増殖させた細胞から形成したコロニーは主にBCR-ABL⁺でしたが、正常なBCR-ABL^-前駆細胞もわずかに存在しました。データは平均値±SEM（n = 6）で表示。P値はtwo-tailed paired Student’s t-testで計算（* P <0.05）。

図5. CD34⁺ AML細胞のコロニー形成能の維持
AML細胞はCD34⁺細胞を分離後（培養0日目）、およびCD34⁺ Expansion Supplement (Exp) を添加したStemSpan™ SFEM II （UM171添加有りまたは無し）で7日間または14日間増殖させた後（図3参照）、MethoCult™ H4435 Enriched培地に播種してコロニーアッセイしました。コロニーを（A）STEMvision™でデジタル画像化し、手動でカウントしました。（B）インプットしたCD34⁺細胞あたりのコロニー総数で表したCFUアウトプット。CD34⁺ Expansion Supplementを添加したSFEM IIは、培養中のコロニー形成前駆細胞の増殖をサポートします。UM171の添加はコロニー形成前駆細胞のアウトプットをさらに促進します（培養7日目で約3倍、14日目で約4倍）。データは平均値±SEM（n = 6）で表示。P値はtwo-tailed paired Student’s t-testで計算（* P <0.05）。