オルガノイド共培養に用いるT細胞の取得（オプション）

EasySep™細胞分離キットで末梢血単核細胞（PBMC）からT細胞を単離し、共培養実験用に採取します。予め分離された新鮮または凍結PBMCを使用すれば、実験時間の節約になります。

あるいは、EasySep™ DirectまたはRosetteSep™細胞分離キットで、全血から直接T細胞を単離します。ヒトT細胞単離用キットの一覧は、こちらからご覧ください。

以下の手順は、EasySep™細胞分離キットでT細胞を取得する一般的な手順です。

1. SepMate™を使用して、ヒト全末梢血からPBMCを取得します（SepMate™単離プロトコル参照）。あるいは、新鮮または凍結保存されたヒト末梢血Leukopakを、Leukopak処理プロトコルに従い細胞分離用に処理します。
2. 細胞懸濁液が調製できたら、使用するEasySep™細胞分離キットの製品情報シートに記載された手順に従いT細胞を分離してください。
3. 高純度に精製されたT細胞は、後で使うために凍結保存するか、ImmunoCult-XF™ T Cell Expansion Mediumで製品情報シートに記載された手順（ステップ2.～5.）に従い増殖させることができます。

オルガノイドおよびT細胞の培養と共培養準備

1. 培地を調製し、IntestiCult™ Organoid Growth Medium (Human) の製品情報シートに記載された手順に従いオルガノイド培養を樹立します。
   
   注：大腸がん（CRC）オルガノイドなどのがん由来オルガノイド培養は、IntestiCult™ OGM Human Basal Mediumを使用して、Wnt非依存性大腸がんオルガノイドに最適化された改変プロトコルと増殖培地で樹立および維持する必要があります。詳しくは、Culturing Cancer-Derived Organoidsを参照してください。
   
   
2. IntestiCult™の製品情報シートに記載された手順に従い、腸オルガノイドを増殖させます。
3. IntestiCult™の製品情報シートに記載された手順に従い、DMEM + 1% BSAを調製します。
4. 共培養で使用する前に、オルガノイドをIntestiCult™ Organoid Growth Medium (Human)で継代してから1〜2日間増殖させます。
   
   注：CRCオルガノイドは、IntestiCult™ OGM Human Basal Mediumのみ（商品コード：ST-100-0190）と等量のDMEM/F-12 with 15 mM HEPES（同：ST-36254）を混合した培地を用いて選択し、増殖させることができます。
   
   
5. 共培養で使用する前に、T細胞をImmunoCult-XF™ T Cell Expansion Mediumで継代または融解してから、1～2日間増殖させます。
6. 共培養用の培地を調製します。
   
   a. IntestiCult™ OGM（オルガノイドががん由来なら基礎培地、それ以外なら完全培地）とImmunoCult-XF™ T Cell Expansion Mediumを同量ずつ混合します。使用するまで氷上に置きます。分注保存されたMatrigel®を氷上で解凍します。
   b. オルガノイド培養で使用する前に、950 μLの氷冷共培養培地につき50 μLの氷冷Matrigel®を加えます。使用するまで氷上に置きます。
   
   
7. Matrigel®からオルガノイドを取り出して洗浄します:
   
   a. 室温の細胞解離試薬 Gentle Cell Dissociation Reagent（GCDR）を各ウェルの露出したドーム上に1 mL加えます。
   b. 室温で1分間インキュベートします。
   c. 予めGCDRで湿らせた1 mLピペットチップを使って、Matrigel®ドームをウェル底から完全にこすり落とします。
   d. ウェル内のGCDRをピペッティングでゆっくりと2〜3回上下させ、ドームとオルガノイドを解離します。すべてのMatrigel®断片がプレートから洗い流されていることを確認してください。
   
   注：ピペッティングする際、ピペットの先端でウェル底に触れないでください。
   
   e. 同じピペットチップを使って、オルガノイド混合物を15 mLコニカルチューブに移します。
   f. 空にしたウェルに1 mLのGCDRを加えます。予めGCDRで湿らせたピペットチップを使って、GCDRをピペッティングで2〜3回上下させ、ウェルをすすぎます。ウェル内容物を、手順e. の15 mLコニカルチューブに移します。
   g. 共培養に使用する各ウェルについて、手順a.〜f. を繰り返します。
   h. チューブを、中速（~40 rpm）に設定した振盪装置上で室温、10分間インキュベートします。
   i. チューブを2〜8°Cで、290 x g、5分間遠心分離します。上清をゆっくり流し出し、捨てます。
   j. 5 mLの氷冷DMEM + 1% BSAを各チューブに加え、穏やかに再懸濁します。
   
   
8. 100 μLあたりのオルガノイド数を定量し、共培養培地100 μLあたりオルガノイド1700個にする必要容量を算出します。
   
   注：播種密度の計算例は、IntestiCult™の製品情報シートに記載されています。
   
   
9. チューブを2〜8°Cで290 x g、5分間遠心分離します。上清をゆっくり流し出し、捨てます。
10. オルガノイドを共培養培地に再懸濁します（50 μL/オルガノイド1700個)。
11. 手順5. で培養したT細胞をオルガノイド懸濁液に加えます（50,000細胞/50 μL）。
    
    注：望ましい量は、100 μLの共培養培地あたりオルガノイド 1,700個およびT細胞 50,000個です。
    
    
12. 100 μLのオルガノイド-T細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに加えます。
13. 組織培養インキュベーター内で、37°C、5% CO₂でインキュベートし、共培養を開始します。

オルガノイド・T細胞共培養における生存率アッセイ

1. オルガノイドの生存率を、CellTiter-Glo® 3D（Promega Benelux BV. カタログ#G9683）を用いて経時的（培養開始から0、3、5日目など）に測定します。
2. さまざまな培地条件でのT細胞の生存率測定用には、T細胞を96ウェルプレートに50,000個/ウェルのトリプリケート条件で播種します。
3. GloCell™ Fixability Viability Dye Red 780（商品コード：ST-75007）とフロー解析により、T細胞の生存率を経時的（培養開始から0、3、5日目など）に測定します。

関連製品

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  IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)

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  ImmunoCult T Cell

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