Control iPSCとは

Healthy Control Human iPSC Line の特長

Healthy Control Human iPSC Line のアプリケーション例

• 研究に初めて導入するiPSC株として
• 創薬、機器・ソフトウェア開発など、商業用途の細胞として
• 分化効率の課題への対処
• 細胞品質など培養上の課題への対処
• 多能性幹細胞ワークフローに多様性を加え、治療薬成功率の向上や副作用リスクの低減に寄与
• mTeSR™ PlusやSTEMdiff™を用いた既存のワークフローへの統合

注意：この製品は「研究用」です。別段の記載がない限り、ヒトまたは動物の診断または治療目的での使用を意図したものではありません。

Healthy Control Human iPSC Line の仕様

形態・容量

• 未分化のヒトiPS細胞凝集体を含むバイアル
• CryoStor® CS10培地中に凍結保存された細胞
• 1バイアルあたり約15,000個のiPS細胞凝集体を含有
• 解凍直後に回収可能なiPS細胞は約10⁶個

細胞のドナー由来

SCTi003-A株は、健康な48歳女性ドナーの末梢血単核細胞 (PBMC) に由来します。ドナーの人口統計学的、健康、および遺伝的な特徴は下表のとおりです（自己申告と全エクソーム配列データに基づく情報）。
SCTi004-A株は、健康な23歳男性ドナーのPBMCに由来します。

表. SCTi003-A株が由来する健康な女性ドナー（SCTi004-A株が由来する健康な男性ドナーについては製品情報ページ [Table. 1] を参照）

1: Self-declared, 2: Calculated

製造・品質管理

SCTi003-A株の製造と品質に関する特徴です。SCTi004-A株については製品情報ページをご覧ください。

• 最適な性能と再現性を確保するために、製造工程でさまざま広範なQCを実施しています
• 核型安定、3胚葉への分化能を示し、未分化マーカーを発現（OCT4⁺, TRA-1-60⁺ ≥ 80%）します
• 非組み込み型技術によってリプログラミングされています
• αβT細胞に由来し、VDJ再構成を受けています

性能

SCTi003-A株およびSCTi004-A株は、以下の性能を備えています。

• mTeSR™ Plusで製造されているため、高品質な維持培養が可能です
• 分化用のSTEMdiff™培地（下記）に完全に適応し、多様な細胞とオルガノイドへ分化できます
• 多能性幹細胞研究の多くのアプリケーションにおいて、健常コントロールとして使用できます

Control iPSCの特徴

女性ドナー由来のSCTi003-A株の特徴を示すデータです（男性ドナー由来のSCTi004-A株も類似の特徴を示します）。

維持培養時のSCTi003-A細胞の高品質な形態

凍結保存したSCTi003-A細胞を解凍し、Corning® Matrigel® MatrixをコートしたmTeSR™ Plus - cGMPで維持培養しました。
（A）iPSCコロニーには細胞が密に詰まっており、継代の準備が整うと多層化を示します。（B, C）細胞は顕著な核小体と高い核対細胞質比を保持しています。

正常な核型を維持

（A）解凍したSCTi003-A細胞に対するp26でのGTLバンディング（n = 20）は、ハプロイドゲノムあたり450 - 550 Gバンドの解像度で、クローン性異常の証拠がない正常な核型を示します。
（B）20p11 （緑）および20q11.21（赤）のプローブを使用した、p26のiPSCにおける蛍光in situハイブリダイゼーションの例。調べた細胞の94%で2個のプローブシグナルが2セット見られ、20番染色体の異数染色体がないことを示しました (n = 200)。

コピー数バリアント（CNV）の特定

マスターセルバンクに保管したSCTi003-A細胞のバイアルからDNAを抽出し、SNPマイクロアレイ解析からCNVを特定しました。 7番および14番染色体上に、それぞれ400 kbを超えるCNVの存在を示しました（太字表示）。これらの欠失はゲノムのTCR領域に位置し、T細胞発生中のVDJ遺伝子再構成プロセスを示しています。

chr = chromosome; start cyto = cytogenetic band at the start of the base pair imbalance; end cyto = cytogenetic band at the end of the base pair imbalance; bp = base pairs; SNP = single nucleotide polymorphism; TCR = T Cell Receptor; VDJ = variable, diversity, joining segment

未分化細胞マーカーの発現

SCTi003-A細胞を、未分化細胞マーカーOCT3/4およびTRA-1-60に対するフローサイトメトリーで分析しました。
（A）マーカーの発現頻度。マスターセルバンクからの解凍後5継代で、3回の反復実験を解析して定量化しました。
（B）TRA-1-60および（C）OCT3/4のフローサイトメトリーのプロット例です。

3胚葉への高い分化能

SCTi003-Aの細胞を3グループに分け、STEMdiff™ Trilineage Differentiation Kit (ST-05230) で各胚葉に分化させ、フローサイトメトリーで分析しました。各胚葉の2つのマーカー発現について、各グループの平均を棒グラフで示しています（n = 2）。
PAX6とNestinは外胚葉系統、NCAMとBrachyury (T) は中胚葉系統、CXCR4とSOX17は内胚葉系統への分化をそれぞれ確認するマーカーです。

Control iPSCから各種細胞への分化

女性（または男性）ドナー由来のSCTi003-A株（またはSCTi004-A株）からさまざまな細胞型へ分化したデータです。

造血前駆細胞への分化とコロニー形成能

STEMdiff™ Hematopoietic Kit（ST-05310） でSCTi003-A細胞から造血前駆細胞（HPC）を作製しました。
（A）分化後のCD34⁺CD45⁺ HPCの頻度とcm²あたりの収量（n = 2）。 （B）SCTi003-A細胞由来のHPCの明視野画像から、これらの細胞が典型的な内皮-造血転換（EHT）を経て移行したことを示しています。
次に、得られたHPCを用いてMethoCult™ SF H4636によるコロニー形成単位（CFU）アッセイ (n = 2) を行いました。（C）14日間のインキュベーション後、コロニーを STEMvision™で画像化し、（D）デジタル画像から算定しました。骨髄系（黒）と赤血球系 （赤）の両方のコロニーが形成されました。

ミクログリアへの分化

STEMdiff™ Hematopoietic Kit（ST-05310）でSCTi003-A細胞から分化させた造血前駆細胞を、さらにSTEMdiff™ Microglia Differentiation and Maturation Kits（ST-100-0019、ST-100-0020）でミクログリアに分化させました。
（A）得られた細胞は小さく、突起を確認でき、Matrigel®に接着せず、ミクログリアに特徴的な小さな細胞質対核比を示します。
（B）フローサイトメトリーでCD45とCD11bの共発現が観察されました。
（C）得られた細胞はポリ-D-リジンに接着し、27日目のMay-Grunwald Giemsa染色での評価によると単球様細胞（細胞質が薄く染まる大きな細胞; 矢印）を< 20%含みます。

神経前駆細胞（NPC）への分化

STEMdiff™ SMADi Neural Induction Kit（ST-08581）でSCTi003-A細胞から単層プロトコルに従って神経前駆細胞（NPC）に分化し、その後凍結保存しました。得られたNPCは解凍後に培養し、免疫細胞化学染色用に固定しました。
NPCは神経前駆細胞マーカー （A）PAX6および（B）SOX1を発現し、（C）クラスIIIβ-チューブリン（TUJ1）を弱く発現します。加えて（D）想定される小さな涙形の形態を示します。
（E）マーカー発現を定量化すると、神経前駆細胞マーカーが90%以上、成熟神経細胞マーカーは10%未満でした。エラーバーは標準偏差を表します（n = 2）。

前脳ニューロン、感覚ニューロンへの分化

SCTi004-A細胞から（A）STEMdiff™ SMADi Neural Induction Kit（ST-08581）で神経前駆細胞、（B）STEMdiff™ Forebrain Neuron Differentiation Kit（ST-08600）で前脳ニューロン、（C）STEMdiff™ Neural Crest Differentiation Kit（ST-08610）で神経堤細胞、（D）STEMdiff™ Sensory Neuron Differentiation Kit（ST-100-0341）で感覚ニューロンにそれぞれ分化しました。分化のプロトコルは各製品添付文書をご参照ください。

心室心筋細胞への分化

STEMdiff™ Ventricular Cardiomyocyte Differentiation Kit（ST-05010）でSCTi003-Aから心室心筋細胞を作製しました。
（A）分化15日目の単層培養には、拍動するiPSC由来心室心筋細胞が見られます。
（B）拍動する心室心筋細胞は、機能解析のために微小電極アレイ（MEA）プレートのウェルに再播種し維持できます。
（C）得られた細胞の89%に心筋細胞マーカーであるトロポニンT（cTnT）の発現がフローサイトメトリーで検出されました。
（D）分化22日目のiPSC由来心室心筋細胞は ~25 BPM（n = 3、平均 +/- SD） で拍動し、(E) MEAで評価される電界電位持続時間は ~500 ms (n = 3、平均+/- SD）でした。

Control iPSCからオルガノイドへの分化

女性ドナー由来のSCTi003-A株からオルガノイドへ分化したデータです。

神経オルガノイドへの分化

STEMdiff™ Dorsal Forebrain Organoid Differentiation Kit（ST-08620）でSCTi003-A細胞から神経オルガノイドに分化させました。背側前脳オルガノイドはSTEMdiff™ Neural Organoid Maintenance Kit（ST-100-0120）で105 日間維持した後に固定し、凍結切片を作製し、免疫蛍光染色しました。
オルガノイドの（A）DAPI（青）、（B）MAP2（マゼンタ）、（C）NEUN（黄色）、（D）GFAP（シアン）の染色画像と（E）4チャンネル合成画像。パネルは63x倍率で細胞レベルの詳細を示し、挿入図は10x倍率で凍結切片全体を示しています。

腸オルガノイドへの分化

（A）STEMdiff™ Intestinal Organoid Kit (ST-05140) で培養するためにSCTi003-A細胞を播種しました。
（B）製品情報シート記載のプロトコル3日目までに単層は均一さを増し、胚体内胚葉パターン化の特性を示します。
（C）中/後腸培地に切り替えた後、単層培養上に3D構造が見え始めます。
（D）分化7日目に中/後腸培養からスフェロイドが分離します。
（E）集めたスフェロイドは、Matrigel®ドームに埋め込んでヒト腸オルガノイドに成熟させることができます。
（F）スフェロイドはマトリックス内でわずか6日で大幅に増殖します。成熟オルガノイドは、STEMdiff™ Intestinal Organoid Growth Medium（ST-05145）で継代および増殖できます。

iPSCdirect™とは

iPSCdirect Healthy Control Human iPSC Line の特長

使い切りタイプのiPSCコントロール株「iPSCdirect™」を使用すれば、iPSC研究用セルバンクの開発や特性解析にかかるコストと労力を減らして長期培養を回避でき、研究のスピードアップに役立ちます。

• iPSCコントロール株 (女性ドナー由来のSCTi003-A) から特別に凍結保存されています
• シングルセル仕様で、使い捨てタイプの製品です
• 1バイアルあたり、1 x 10⁷個の未分化iPSCを含みます
• SCTi003-Aと同様、業界標準以上の広範な品質管理を受けています *
• mTeSR™ Plus で製造、DMSO含有培地で凍結されています
• 播種後24時間でスクリーニングや分化に使用でき、iPSC単層培養の維持は不要です
• 使い捨て使用時、ライセンスは不要です **

* 品質に関するデータは、製品情報ページを参照

** 未分化状態 (ゲノム編集後を含む) の細胞を維持または増殖するには、ユーザーはiPSCの標準ライセンス契約を締結する必要があり、年間ライセンス料が適用される場合があります。

注意：この製品は「研究用」です。別段の記載がない限り、ヒトまたは動物の診断または治療目的での使用を意図したものではありません。

単層培養での分化プロトコルに最適化されています

iPSCdirectは以下のSTEMdiffキットで分化できることを確認済です。その他の単層ベースの分化との適合性についてはお問い合わせください。

神経前駆細胞 (NPC) への分化

iPSCdirect™ SCTi003-A 細胞からNPCを作製しました。iPSCdirect™ 製品情報シートのプロトコルに続き、STEMdiff™ SMADi Neural Induction Kit (ST-08581) の単層プロトコル (Day 1~) を実施しました。プロトコルの最初の7日間後、得られた NPC を固定し免疫細胞化学で解析しました。
NPC は神経前駆マーカー (A) SOX1 および (B) PAX6 を発現し、核は (C) DAPI で可視化しました。 (D) マーカー発現を定量化し、ネガティブコントロール SOX10 の発現は最小限でした。エラーバーは標準偏差を表します (n = 2 生物学的複製)。

心室性心筋細胞への分化

iPSCdirect™ SCTi003-A 細胞から心室心筋細胞を作製しました。
(A) 解凍して mTeSR™ Plus および CloneR™2 にプレーティングしてから48時間後、iPSCdirect™ 細胞は望ましいコンフルエントに達し、分化の準備が整いました (分化0日目)。
(B) STEMdiff™ Ventricular Cardiomyocyte Differentiation Kit (ST-05010) による分化15日目までに、単層培養物は (C) 協調して拍動する iPSC 由来の心室心筋細胞になります。

肝細胞様細胞への分化

iPSCdirect™ SCTi003-A 細胞から肝細胞様細胞を作製しました。
(A) STEMdiff™ Hepatocyte Kit (ST-100-0520) による分化21日目までに、特徴的な多角形形態と二核を有する肝細胞様細胞の単層が明らかになります。
(B) 肝臓マーカーであるアルブミン (ALB) およびアルファ1-アンチトリプシン (A1AT) の発現をフローサイトメトリーで定量しました。 エラーバーは標準偏差を表します (n = 3 生物学的複製)。

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